Kim loại nguyên tố, Bạc (Ag) có tác dụng kháng khuẩn phổ rộng chống lại các vi khuẩn, nấm và virus khác nhau. Do tính linh hoạt của chúng, các hạt nano Ag (AgNP) hiện đã được tìm thấy như một chất diệt vi khuẩn cho các bề mặt sinh học ở nhiều dạng khác nhau như băng vết thương, thiết bị y tế, thuốc xịt khử mùi và vải.

Một số nghiên cứu đã chứng minh tác dụng kháng virus mạnh mẽ của AgNP đối với các virus gây bệnh ở người khác nhau như virus hợp bào đường hô hấp (RSV), virus cúm, virus Norovirus, virus viêm gan B (HBV) và virus suy giảm miễn dịch ở người (HIV). Ngoài những virus này, vì Ag đã được chứng minh là có thể tiêu diệt SARS-CoV, chúng tôi đã đưa ra giả thuyết về khả năng ức chế mạnh mẽ của AgNPs trong việc ức chế SARS-CoV-2.

Cho đến nay, không có nghiên cứu nào chứng minh trực tiếp ảnh hưởng của AgNPs đối với SARS-CoV-2. Chúng tôi đã thử nghiệm các hạt nano bạc dạng keo (cAg), các hạt nano Ag nguyên tố đơn giản có đường kính khác nhau (AgNP n ) và polyvinylpyrolidone có giới hạn các hạt nano bạc 10 nm (PVP – AgNP 10 ) chống lại SARS-CoV-2 để tìm ra kích thước và nồng độ Ag hiệu quả nhất có thể ức chế SARS-CoV-2. Chúng tôi đề xuất rằng AgNPs có thể được sử dụng trên các bề mặt, không khí và phi sinh học để kiểm soát hiệu quả đại dịch COVID-19 đang diễn ra.

Vật liệu và phương pháp
1.Mẫu SARS-CoV-2

Xét nghiệm mảng bám được thực hiện SARS-CoV-2 trên các dòng tế bào VeroE6 / TMPRSS2 và Calu-3. Dung dịch virus được pha loãng 10 lần trong FBS / DMEM 2% và được ủ ở 37oC trong 96h.

Sau đó các tế bào được cố định bằng 4% formalin và nhuộm bằng màu tím pha lê 0,25%.

2. Mẫu nano bạc

PVP-AgNP 10 ở nồng độ gốc 20 ppm (Cat No: 795925) và cAg (Cat No: 85131) thu được từ Sigma. AgNP có kích thước hạt khác nhau; AgNP 2 (Cat No: US7150), AgNP 15 (Cat No: US7091), AgNP 50 , AgNP 80 and AgNP 100 (US1038W) đã được mua từ US Research Nanomaterials, Inc. nồng độ được chuẩn bị bằng cách pha loãng trong nước cất vô trùng.

Nghiên cứu tương tác Nano bạc và SARS-CoV-2
1. Xét nghiệm tiền xử lý vi rút

Virus ở MOI là 0,05 (đối với VeroE6 / TMPRSS2) hoặc 0,5 (đối với Calu-3) trong DMEM chứa 2% FBS được ủ với dung dịch AgNP 2 ppm trong 1 giờ ở 37 ° C. Hỗn hợp virus-AgNP tương ứng được thêm vào tế bào VeroE6 / TMPRSS2 hoặc Calu-3 trong 96 đĩa và ủ trong 48 giờ hoặc 96 giờ tương ứng ở 37 ° C. Khả năng sống sót của tế bào được định lượng bằng xét nghiệm CellTiter-Glo và các bản sao của virus trong dịch nổi được định lượng bằng RT-qPCR.

2. Xét nghiệm tế bào sau xử lý

Tế bào VeroE6 / TMPRSS2 bị nhiễm SARS-CoV-2 (MOI = 0,05) và được ủ trong 2 giờ ở 37 ° C. Các giếng được rửa bằng PBS để loại bỏ virusngoại bào và phủ DMEM chứa 2% FBS với 2 ppm PVP-AgNP 10 và ủ trong 48 giờ ở 37 ° C. Khả năng sống sót của tế bào được định lượng bằng xét nghiệm CellTiter-Glo và các bản sao của virus trong dịch nổi được định lượng bằng RT-qPCR.

3. Xét nghiệm tiền xử lý tế bào

Tế bào VeroE6 / TMPRSS2 được xử lý bằng 2 ppm PVP-AgNP 10 và ủ trong 3 giờ ở 37 ° C. Các đĩa sau đó được rửa bằng PBS để loại bỏ AgNPs tự do trong môi trường và phủ DMEM có chứa 2% FBS với SARS-CoV-2 (MOI = 0,05) và ủ trong 48 giờ ở 37 ° C. Khả năng sống sót của tế bào được định lượng bằng xét nghiệm CellTiter-Glo và các bản sao của virus trong dịch nổi được định lượng bằng RT-qPCR

KẾT QUẢ
1. Độc tính tế bào, liều lượng hiệu quả và thời gian tiếp xúc nano bạc

AgNP thể hiện độc tính tế bào đối với tế bào động vật có vú bằng cách tạo ra các loại oxy phản ứng (ROS). Chúng tôi muốn đánh giá độc tính tế bào phụ thuộc nồng độ độ Ag biểu hiện trên các dòng tế bào VeroE6 / TMPRSS2 (không phải người) và Calu-3 (tế bào biểu mô phổi của người). cAg được pha loãng theo dõi và thêm vào các tế bào trong 96 đĩa giếng và khả năng sống của tế bào được đánh giá sau 48 giờ sử dụng xét nghiệm CellTiter-Glo. Ag được phát hiện thể hiện độc tính tế bào ở nồng độ từ 20 phần triệu (ppm) trở đi trong cả VeroE6 / TMPRSS2 (Hình 1 A) và dòng tế bào Calu-3 (Hình 1B).

Hình 1: Độc tính tế bào nano bạc. (A): VeroE6 / TMPRSS2 (không phải người), (B): Calu-3 (tế bào biểu mô phổi của người)

Kết quả cho thấy sử dụng nano bạc ở nồng độ <20ppm trong 48h hoàn toàn không gây độc tế bào ở người.

2. Hiệu quả kháng virus SARS-CoV-2 của nano bạc

Hiệu quả kháng virus phụ thuộc vào nồng độ và liều lượng của các hạt nano bạc trên SARS-CoV-2

Hình 2: Hiệu quả kháng virus sars-cov-2 của nano bạc. (A): Keo bạc cứu tế bào VeroE6 / TMPRSS2 khỏi chết của tế bào qua trung gian SARS-CoV-2 theo cách phụ thuộc vào nồng độ. (B): Sự ức chế phụ thuộc nồng độ đối với sự sao chép của SARS-CoV-2 trong tế bào Calu-3 bằng bạc keo. (C) : Các hạt nano bạc thể hiện tác dụng kháng virus phụ thuộc vào kích thước đối với SARS-CoV-2 trong tế bào Vero / TMPRSS2. (D): Sự ức chế virus phụ thuộc vào kích thước hạt đối với SARS-CoV-2 bằng các hạt nano bạc trong tế bào Calu-3

Kết quả cho thấy hiệu quả ức chế tối ưu virus SARS-CoV-2 của nano bạc ở nồng độ 10ppm, kích thước hạt <100nm.

Nghiên cứu khoa học thời gian được thực hiện dựa trên VPrA với PVP-AgNP 10 cho thấy sự ức chế đáng kể sau 30 phút tiếp xúc và gần như hoàn toàn ở thời gian 1h.

3. Bạc ức chế virus ngoại bào bằng cách ngăn chặn sự xâm nhập của virus

Thí nghiệm được chia làm 3 thí nghiệm cho 2 trường hợp để quan sát khả năng sống của tế bào và khả năng sao chép của virus SARS-CoV-2.

Nano bạc được sử dụng trong thí nghiệm ở nồng độ 2ppm, kích thước hạt 10nm.

Hình 3: Khả năng ức chế virus ngoại bào của hạt nano bạc

Giải thích thuật ngữ (Hình 3A):

VprA: xét nghiệm tiền xử lý virus. Dung dịch chứa virus được ức chế bằng nano bạc trong 1h sau đó được cho lây nhiễm với tế bào VeroE6 / TMPRSS2 (không phải người) trong 48h.
CPoA: xét nghiệm sau xử lý tế bào. Tế bào VeroE6 / TMPRSS2 (không phải người), được cho lây nhiễm virus SARS-CoV-2 trong 2h, sau đó được xử lý bởi các hạt nano bạc trong 48h.
CPrA: Xét nghiệm tiền xử lý tế bào. Tế bào VeroE6 / TMPRSS2 (không phải người) được xử lý bằng nano bạc trong 3h, sau đó được cho lây nhiễm với virus SARS-CoV-2 trong 48h.

Trường hợp 1 (Hình 3B): Hiệu suất của các hạt nano bạc được phủ PVP trong ba thí nghiệm nghiên cứu liên quan đến việc cứu tế bào khỏi sự lây nhiễm SARS-CoV-2

Trường hợp 2 (Hình 3C): Hiệu suất của các hạt nano bạc được phủ PVP trong ba thí nghiệm nghiên cứu liên quan đến việc giảm sự sao chép của SARS-CoV-2

Kết quả thí nghiệm này cho thấy tế bào đã bị nhiễm bệnh được xử lý bằng nano bạc giúp khả năng sống của tế bào tăng lên, khả năng sao chép virus bị ức chế hoàn toàn.

Thảo luận

Ag được biết đến từ lâu với tác dụng kháng khuẩn và đặc tính kháng virus của AgNPs đang được nghiên cứu rộng rãi với sự quan tâm mới trong quá khứ gần đây.

Cơ chế chính xác mà AgNPs phát huy tác dụng tiêu diệt virus vẫn còn chưa rõ ràng. Tuy nhiên, người ta đã quan sát thấy một cách nhất quán rằng AgNP tương tác với các protein cấu trúc trên bề mặt của virus ngoại bào để ức chế sự lây nhiễm trong giai đoạn đầu, bằng cách ngăn chặn sự gắn kết hoặc xâm nhập của virus, hoặc bằng cách làm hỏng các protein bề mặt để ảnh hưởng đến tính toàn vẹn cấu trúc của virion.

Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đã thu được những phát hiện tương tự trong VPrA nơi AgNPs ức chế hiệu quả SARS-CoV-2 ngoại bào để bảo vệ tế bào đích khỏi bị nhiễm trùng và xét nghiệm xâm nhập pseudovirus cho thấy rằng AgNPs cản trở sự xâm nhập của virus.

AgNPs đã được chứng minh là liên kết ưu tiên với các protein bề mặt của virus giàu nhóm sulfhydryl và phân cắt các liên kết disulfide để làm mất ổn định protein, do đó ảnh hưởng đến khả năng lây nhiễm của virus. Các nghiên cứu về HIV đã chỉ ra rằng AgNPs liên kết với các liên kết disulfide gần với vùng liên kết CD4 của protein bề mặt gp120.

Hati và Bhattacharyya đã chứng minh tầm quan trọng của liên kết disulfide trong việc liên kết của protein đột biến SARS-CoV-2 với thụ thể men chuyển angiotensin-2 (ACE2) và sự gián đoạn của nó dẫn đến suy giảm liên kết của virus với thụ thể. Xem xét cơ chế hoạt động của AgNPs được chỉ ra bởi các tác giả khác, có thể giả định rằng AgNPs phát huy tác dụng kháng virus đối với SARS-CoV-2 bằng cách phá vỡ các liên kết disulfide trên protein đột biến và các thụ thể ACE2. Các nghiên cứu sâu hơn đang được tiến hành để tìm ra cơ chế kháng virus của AgNPs trên SARS-CoV-2 và làm sáng tỏ nó một cách chi tiết trong những công bố sau.

Tác dụng kháng vi rút của AgNPs cũng phụ thuộc vào nồng độ. Hầu hết các nghiên cứu đã quan sát thấy hiệu quả kháng vi rút của AgNPs ở nồng độ từ 10 đến 100 ppm. Tuy nhiên, 0,5 ppm cAg đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc ức chế virus Cúm và là nồng độ ít nhất được báo cáo cho thấy hoạt tính kháng virrus. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đã quan sát thấy AgNPs để ức chế SARS-CoV-2 ở nồng độ từ 1 đến 10 ppm và trở thành chất độc tế bào đối với tế bào động vật có vú từ 20 ppm trở lên.

Độc tính tế bào của AgNPs đối với tế bào động vật có vú phụ thuộc vào loại tế bào và cũng là loại AgNPs. Mehrbod và cộng sự đã quan sát thấy độc tính tế bào trong tế bào Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) với các hạt cAg trần ở nồng độ cao hơn 0,5 ppm.

AgNPs trần với chất khử NaBH4 được phát hiện gây ra quá trình chết rụng ở tế bào ung thư biểu mô tuyến ruột kết ở 11 ppm, trong khi AgNPs trần được ổn định bằng Citrate đã được quan sát thấy thể hiện độc tính tế bào ở nồng độ cao hơn 30 ppm. Về vấn đề này, AgNP phủ PVP đã được chứng minh là ít gây độc tế bào mà không có độc tính tế bào nào có thể chứng minh được ngay cả ở 50 ppm trong tế bào biểu mô đáy phế nang của người.

Các hạt nhỏ hơn có tiềm năng độc hại cao hơn do diện tích bề mặt tương tác với protein liên kết lớn hơn. Chúng tôi quan sát thấy hiệu ứng này vì AgNP 2 cho thấy độc tính tế bào ngay cả ở 2 ppm trong khi không có hạt nào lớn hơn gây độc tế bào ở nồng độ này. Do đó, cần thận trọng khi sử dụng Ag trên các bề mặt sinh học.

Nano bạc được tạo ra bởi rất nhiều phương pháp và chất khử cũng như chất bảo vệ mỗi loại đều khác nhau. Các nano bạc được tạo ra từ chất khử và chất bảo vệ từ gốc hữu cơ an toàn hơn nhiều so với nano bạc được khử bằng NaBH4, hydrazine,….

AgNPs có thể được sử dụng trên nhiều bề mặt khác nhau để chống lại đại dịch COVID-19 đang diễn ra. Khẩu trang tráng Ag đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc ức chế SARS-CoV-2 và có thể có hiệu quả khi được áp dụng trên bộ lọc không khí của máy điều hòa không khí và thiết bị y tế. Vải polycotton kết hợp AgNP đã được chứng minh là có khả năng ức chế SARS-CoV-2. Chất khử trùng dựa trên Ag cũng đang được sử dụng để khử trùng tay và các bề mặt tương ứng.